Příprava expresních konstruktů interakčních partnerů fosducinu.

Abstract

Klíčová slova: SUG1, fosducin, G proteinová signální dráha, exprese, pGEX-4T-1, pST39 Fosducin je kyselý cytosolický protein, který se účastní regulace G proteinové signální dráhy v tyčinkách fotoreceptorů a má vliv na stresem indukovanou hypertenzi. Jedním z jeho důležitých interakčních partnerů je protein SUG1, který je součástí 26S proteasomu a řadí se do rodiny proteinů majících ATPasovou aktivitu. Tato bakalářská práce je součástí širšího výzkumu, který se snaží objasnit fyziologické funkce interakce mezi proteiny SUG1 a fosducinem. Hlavním cílem této práce bylo připravit expresní konstrukty proteinu SUG1 (lidská isoforma 1), které budou vhodné pro přípravu tohoto proteinu v bakteriích E. coli BL21 (Rosetta). Gen kódující protein SUG1 byl vnesen do dvou různých plasmidových DNA určených pro expresi rekombinantních proteinů v bakteriích. Sekvence připravených konstruktů byla ověřena pomocí sekvenace a následně byly provedeny expresní testy, které potvrdily produkci rekombinantních fusních proteinů. Hlavním výsledkem této bakalářské práce bylo zjištění, že se protein SUG1 (lidská isoforma 1) v expresním systému E. coli BL21 (Rosetta) dobře exprimuje. Toto zjištění je základem pro budoucí vývoj purifikačního protokolu a následné studium biofyzikálních vlastností tohoto proteinu a jeho interakcí s...

Key words: SUG1, phosducin, G protein signaling, expression, pGEX-4T-1, pST39 Phosducin is an acidic protein found in cytosol and is involved in G protein signaling within rods of photoreceptors. Phosducin also influences stress-dependent hypertension. One of phosducin's important binding partners is SUG1, a 26S proteasome subunit, which belongs to a family of proteins that have an ATPase activity. This bachelor thesis takes part in a broader research, which tries to clarify physiological functions of the interaction of SUG1 with phosducin. Main goal of this study was to prepare constructs of SUG1 (human isoform 1) suitable for the recombinant protein production in an expression system E. coli BL21 (Rosetta). Gene that encodes SUG1 was inserted into two different plasmid DNAs that allow expression of SUG1 as two different fusion proteins in a prokaryotic expression system. Nucleotide sequences of these constructs were verified using sequencing. Next, expression tests revealed sufficient production of both recombinant fusion proteins. The main result of this bachelor thesis is the successful expression of human SUG1 in E. coli BL21 (Rosetta) cells. This result will enable the development of the purification protocol for the large scale expression of both recombinant fusion proteins as well as the...