Stanovení methotrexátu a 7-hydroxymethotrexátu metodou HPLC a korelace s imunochemickým stanovením celkového methotrexátu

Abstract

SOUHRN Cílem této bakalářské práce bylo ověřit korelaci při stanovení methotrexátu mezi vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a imunochemickým stanovením celkového methotrexátu. Methotrexát patří mezi cytostatika využívající se ve vysokodávkové terapii k léčbě akutní lymfoblastické leukémie. Chromatograficky byl methotrexát stanovován s UV detekcí při 303 nm po deproteinizaci kyselinou trichloroctovou. Fluorescenční polarizační imunoanalýzou byl methotrexát měřen na analyzátoru TDx FLx. Získaná data byla vyhodnocena statistickým programem PrismGraph Pad 5.0. Pomocí statistické analýzy bylo zjištěno, že se jedná o neparametrické rozložení dat na hladině pravděpodobnosti 95%. Data byla vyhodnocena neparametrickým párovým t-testem. V této práci bylo zjištěno, že obě metody spolu velmi dobře korelují u hodnot > 1 μmol/l. Zatímco u hodnot nižších než 1 μmol/l dochází k nadhodnocování při stanovení pomocí fluorescenční polarizační imunoanalýzy. Toto nadhodnocování je pravděpodobně způsobeno zkříženými reakcemi s metabolity 7-hydroxymethotrexátem a 2,4-diamino-N10 -methylpteroovou kyselinou zejména v terminální fázi časového průběhu poklesu methotrexátu. Důvodem může být velice podobná chemická struktura methotrexátu a jeho metabolitů. Klíčová slova: methotrexát, 7-hydroxymethotrexát, 2,4-diamino-N10...

The aim of this work was to verify the correlation at determination of methotrexate by high performance liquid chromatography and imunochemically determination of whole methotrexate. Methotrexate belongs to the chemotherapeutic agent commonly used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia. Methotrexate was determined chromatographicly with UV detection at 303 nm after deproteinization with trichloracetic acid. Fluorescence polarization immunoassays of methotrexate was measured on TDx FLx analyzer. The data obtained were analyzed utilizing the PrismGraph Pad 5.0 software. The methotrexate measurements were evaluted employing nonparametric paired t-test (p-value <0,05). Our data indicate good correlation between methotrexate levels > 1 μmol/l determined by high performance liquid chromatography and fluorescence polarization immunoassays. While the concentration of methotrexate < 1 μmol/l measured by fluorescence polarization immunoassays were overestimated. This could be done because of cross reactivity with metabolites 7-hydroxymethotrexate and 2,4-diamino-N10 -methylpteroic acid. These metabolites could influence the determination of methotrexate, because of the close stuctural similarities.