Mechanizmus inhibičního účinku kyseliny ethakrynové na růst viru vakcínie

Abstract

Virus vakcínie (VACV) je celosvětově znám pro své využití v eradikační kampani proti viru varioly (VARV), původci pravých neštovic. Roku 1980 prohlásila WHO VARV za vymýcený a tímto rokem tak ukončila celoplošné očkování. Vzhledem k obavám ze zneužití varioly pro bioteroristické účely začaly některé země po roce 2001 opět očkovat vybrané skupiny obyvatelstva. Nově proto vyvstala otázka léčby nejen pravých neštovic, ale také postvakcinačních komplikací a následků přenosu VACV na běžnou populaci. V roce 2009 popsala laboratoř Dr. Mělkové inhibiční účinek kyseliny ethakrynové (EA) na růst VACV na úrovni exprese pozdních genů. Cílem mojí diplomové práce bylo provést detailnější studii účinku EA na pozdní proteosyntézu a na některé další fáze replikačního cyklu VACV. Ke splnění zadaného úkolu byly použity tyto metody: infekce tkáňových kultur, plaková zkouška, northern blot, slot blot, western blot, přímá i nepřímá imunofluorescence fixovaných buněk a fluorescence EGFP exprimovaného VACV v živých infikovaných buňkách. Prvním úkolem bylo zjistit, zda EA ovlivňuje transkripci, či translaci pozdních genů VACV. Naše výsledky ukazují, že EA nesnižuje hladinu pozdních mRNA VACV a pravděpodobně tedy účinkuje na úrovni jejich translace. Dále jsme se zabývaly studiem efektu EA na fáze následující po expresi...

Vaccinia virus (VACV) is globally known for its use in the eradication campaign against variola virus (VARV), the causative agent of smallpox. In 1980, WHO declared VARV as eradicated and the worldwide immunization has been stopped. After 2001, vaccination of selected groups of population was re-introduced because of concerns about variola misuse for bioterrorist purposes. Therefore, drugs effective against variola, post-vaccination complications and consequences of VACV transmission in the population, are intensively studied again. In 2009, laboratory of Dr. Mělková demonstrated that ethacrynic acid (EA) inhibited growth of VACV at the level of late gene expression. The goal of my diploma thesis was to perform a detailed study of the effects of EA on VACV late protein synthesis and on other stages of VACV replication cycle. To this end, the following methods were used: infection of tissue culture cells, plaque assay, northern blot, slot blot, western blot, direct and indirect immunofluorescence of fixed cells and fluorescence of EGFP expressed by VACV in infected live cells. First, we wanted to determine whether EA affects VACV late gene transcription or translation. Our results indicate that EA does not decrease levels of VACV late gene mRNA's and therefore, it probably affects late gene...