Steps towards the development of an in vitro assay of early endosome fusion
Vývoj metody pro in vitro hodnocení fúze časných endosomů
diploma thesis (DEFENDED)
View/ Open
Permanent link
http://hdl.handle.net/20.500.11956/6020Identifiers
Study Information System: 17445
Collections
- Kvalifikační práce [6634]
Author
Advisor
Referee
Čečková, Martina
Faculty / Institute
Faculty of Pharmacy in Hradec Králové
Discipline
Pharmacy
Department
Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Control
Date of defense
5. 6. 2006
Publisher
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci KrálovéLanguage
English
Grade
Excellent
7. SHRNUTÍ Tato diplomová práce byla zpracována pod záštitou programu SOCRATES/ ERASMUS na Welsh School of Pharmacy v Cardiffu. Cílem mé práce bylo modifikovat již vyvinutou metodu (Wessling-Resnick M. et al., January 1990) a přizpůsobit ji podmínkám tamní laboratoře. Předmětem studia byla subpopulace tzv. časných endosomů, které vznikají těsně při povrchu plasmatické membrány po rozpadu klatrinového pláště. Jednou z jejich vlastností je schopnost spojovat se, fúzovat, čímž vzniká nadbytečná membrána potřebná pro další osud těchto organel. Ve svých experimentech jsem pracovala se dvěma komplementárními markery. Jedním z nich byl avidin navázaný na enzym -galaktosidasu, která štěpí kromě laktosy také syntetické substráty za vzniku příslušných produktů. V této studii byl produktem specifické hydrolýzy methylumbeliferylgalaktosidu intenzivně fluoreskující methylumbeliferon. Druhým markerem byl biotinylovaný transferin. Podstatou komplementarity markerů je vysoká afinita avidinu k biotinu. Dvě skupiny buněk byly inkubovány se zmíněnými markery a po jejich akumulaci v endosomech následovala mechanická destrukce buněk za uvolnění organel. Oba typy endosomů byly smíchány v prostředí podporujícím jejich fúzi. Spojením dvou endosomů nesoucích různé markery došlo k jejich rychlé kombinaci za vzniku komplexu...