Klonování, exprese a purifikace mykobakteriální dihydrofolátreduktasy

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Řešitel: Kateřina Šedivá Školitel: Mgr. Eva Novotná, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace mykobakteriální dihydrofolátreduktasy Dihydrofolátreduktasa je enzym nezbytný pro metabolismus kyseliny listové - katalyzuje redukci dihydrofolátu na tetrahydrofolát. Tetrahydrofolát je důležitým kofaktorem při reakcích přenášejících jednouhlíkaté zbytky. Hraje klíčovou roli v syntéze DNA, RNA a proteinů. Dihydrofolátreduktasa se nachází také u M. tuberculosis. Tato bakterie je nejčastějším původcem tuberkulózy u lidí. Právě dihydrofolátreduktasa by mohla být potenciálním cílem pro vývoj nových antituberkulotik. Rekombinantní protein dihydrofolátreduktasa byl připraven v několika krocích. Sekvence kódující protein byla nejprve amplifikována polymerásovou řetězovou reakcí. Ligací namnoženého úseku DNA a plazmidu pET-28b(+) vznikl rekombinantní plazmid, který byl metodou tepelného šoku transformován do kompetentních buněk E. coli kmen HB101. K expresi proteinu byly použity buňky E. coli kmen BL21(DE3). Samotná exprese byla indukována přidáním isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Získaný rekombinantní protein byl izolován a purifikován metodou afinitní chromatografie. Metodou dle Bradfordové...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Kateřina Šedivá Supervisor: Mgr. Eva Novotná, Ph.D. Title of diploma thesis: Cloning, expression and purification of mycobacterial dihydrofolate reductase Dihydrofolate reductase is an enzyme essential for the metabolism of folic acid - it catalyzes the reduction of dihydrofolate to tetrahydrofolate. Tetrahydrofolate is an important cofactor involved in one-cabron transfer reactions. Dihydrofolate reductase plays a key role in the synthesis of DNA, RNA and proteins. Dihydrofolate reductase was also found in M. tuberculosis. This bacterium is the most common causative agent of tuberculosis in humans. Thus dihydrofolate reductase could be a potential target for the design of new antituberculotics. The recombinant protein dihydrofolate reductase was prepared in several steps. The coding sequence of the protein was first amplified by polymerase chain reaction. A recombinant plasmid, obtained by the ligation of an amplified segment of DNA with plasmid pET-28b(+), was transformed into competent cells E. coli strain BH101 by the heat shock method. Cells E. coli strain BL21(DE3) were used for the protein expression. The expression was induced by the addition of isopropyl-β-D-...