Vyšetření deficitu v alfa-1-antitrypsinovém genu pomocí real-time PCR

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Autor: Bc. Petra Blažková Školitel: Doc. PharmDr. Martin Beránek Ph.D. Název diplomové práce: Vyšetření deficitu v alfa-1-antitrypsinovém genu pomocí real-time PCR Diplomová práce se zaměřuje na validaci metody PCR v reálném čase (real-time PCR) pro vyšetření mutací Z a S v genu SERPINA1, který se nachází na dlouhém raménku 14. chromozómu (14q32.13) a obsahuje pokyny pro přípravu proteinu zvaného alfa-1- antitrypsin (A1AT). A1AT je inhibitor serinových proteáz a chrání tkáně před degradací neutrofilní elastázou. Nedostatek, který je nejčastěji způsoben právě těmito mutacemi, může způsobit onemocnění plic a jater u dětí a dospělých. Metoda real-time PCR se po úspěšné validaci aplikovala na soubor 46 klinických vzorků DNA získaných z krve a 30 vzorků DNA z buněk bukální sliznice. Izolace DNA byla provedena extrakcí kitem QIAamp® DNA Mini Kit od firmy QIAGEN. Ke genotypizaci jsem použila sadu primerů a hybridizačních sond dle Snydera (2006). Analýza teploty tání probíhala v termocykléru LightCycler 1.2. Výsledky vzorků DNA získaných z krve byly následně porovnány s výsledky získanými akreditovanou metodou založenou na principu PCR/RFLP. Obě metody dávaly 100% shodné výsledky. V těchto vzorcích byla zjištěna...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Petra Blažková Supervisor: Doc. PharmDr. Martin Beránek Ph.D. Title of diploma thesis: Alpha-1-antitrypsin deficiency analysis using real-time PCR This diploma thesis focuses on the validation of the method PCR in real-time (real-time PCR) to investigate the Z and S mutations in the gene SERPINA1, located at the long arm of chromosome 14 (14q32.13) and provides instructions for making a protein named alpha-1- antitrypsin (A1AT). A1AT is a serine protease inhibitor that protects tissues from degradation by neutrophil elastase. Deficiency, which is most commonly caused by these mutations, can cause children and adult's liver and lung disease. A method of real-time PCR was applied after successful validation to a set of 46 clinical samples of DNA extracted from blood samples and 30 samples of the DNA from cells of the buccal mucosa. DNA isolation was performed by kit extraction QIAamp ® DNA Mini Kit by QIAGEN. I used a set of primers and hybridization probes according to Snyder (2006) for genotyping. Melting curve analysis was carried out in the thermocycler LightCycler 1.2. Results of DNA samples obtained from blood were compared with the results obtained through an accredited method...