Optimalizace heteroduplexní analýzy, TGGE, k diagnostice dědičných onemocnění.

Abstract

Diplomová práce se zabývá optimalizací gelové elektroforézy s teplotním gradientem (TGGE, temperature gradient gel electrophoresis) k diagnostice mutací v genu GJB2. Tento gen kóduje protein connexin 26, který je součástí vnitřního ucha. Mutace v genu GJB2 jsou nejčastější příčinou vrozené hluchoty, obvykle s autozomálně recesivní dědičností. Pro optimalizaci heteroduplexní analýzy TGGE byly vybrány vzorky DNA se známými genotypy nesoucí mutace c.35delG, W24X a c.358-360delGAG. Vzorky byly poskytnuty Oddělením lékařské genetiky Fakultní nemocnice Hradec Králové. Metoda TGGE slouží k separaci nukleových kyselin. Oproti klasické elektroforéze je v této metodě navíc podél celé délky gelu vytvořen teplotní gradient. Vzorek DNA se pohybuje v elektrickém poli rychlostí úměrnou své velikosti. V určité teplotě však začne docházet k denaturaci vláken, což se projeví zpomalením rychlosti migrace. Teplota tání je velmi závislá na primární struktuře analyzovaného úseku DNA, tím pádem lze ve výsledku na gelu rozlišit i stejně dlouhé fragmenty lišící se svou sekvencí bází. Optimalizace proběhla u dvou překrývajících se úseků kódující části genu GJB2. Vhodné primery a analytické podmínky byly nalezeny pro oba úseky genu. Ukázalo se, že pro lepší rozlišení homozygotních jednonukleotidových variant mutací je třeba...

The diploma thesis is focused on optimalization of temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) for diagnosing of mutations in the GJB2 gene. This gene encodes the protein connexin 26, which is part of the inner ear. Mutation in the gene GJB2 are the most common cause of congenital deafness, usually with autosomal recessive inheritance. DNA samples with known genotypes, which included the mutation c.35delG, W24X and c.358- 360delGAG were selected for the optimization heteroduplex analysis TGGE. The samples were provided by the Department of Medical Genetics, University Hospital Hradec Králové. TGGE method is used to separate nucleid acids. Compared to conventional electrophoresis, there is created a temperature gradient across the gel. The sample of DNA moves in an electric field at a speed proportional to their size. However, at the specific temperature, the strands begin to separate, which results in slowing down the speed of migration. The melting temperature is highly dependent on the primary structure of the analyzed segment of DNA, which allows to differentiate the same lenght fragment having different base sequences. Optimization was performed in two overlapping sections of the encoding part of the gene GJB2. Useful primers and analytical conditions have been found for both sections of...