Studium aktivace glykoproteinu CD44 pomocí specifické monoklonální protilátky

Abstract

AML je akutní myeloidní leukémie charakterizovaná přítomností velkého množství myeloidních prekurzorů, které ztratily schopnost diferenciace. Navázání monoklonálních protilátek anti-CD44 na glykoprotein CD44 umožňuje diferenciaci leukemických blastů. CD44 glykoprotein je významný receptor pro hyaluronovou kyselinu a podílí se na buněčné adhezi a migraci. Pro pochopení mechanizmu myeloidní diferenciace pomocí specifických monoklonálních protilátek a k potvrzení hypotézy, jež předpokládá odštěpení úseku intracelulární části molekuly CD44 a migraci ICD do jádra, byly použity THP-1 a CHO buněčné linie transfektované molekulou CD44 značenou molekulou Myc Tag. Prvním úkolem bylo izolovat z ascitu protilátku H90 pomocí chromatografické kolony. Poté byla použita SDS PAGE elektroforéza k ověření čistoty izolované protilátky. Dále byla ověřena funkčnost protilátky. Výběr vhodných kmenů THP-1 a CHO buněk proběhl pomocí selektivního media a pomocí analýzy FACS. K analýze ICD oblasti značené tagem byla použita metoda Western Blot, jež se ukázala jako nedostatečně citlivá. Následně byla použita imunofluorescence se specifickými protilátkami proti Myc Tag. Konečné výsledky ukázaly možnost detekce molekuly ICD Myc v buněčném jádře po předchozím navázání monoklonální protilátky H90.

Acute myeloid leukemia (AML) is an heterogenous leukemia characterized by the blockage of myeloid differentiation at different stages. The ligation of CD44 with specifics monoclonal antibodies (MAbs) (A3D8 and H90), triggers terminal differentiation of leukemic blasts in AML-M1/2 to AML-M5 subtypes. The CD44 surface antigen is the most important hyaluronic acid receptor and is involved in cell adhesion and migration. To investigate the mechanism of myeloid differentiation due to CD44 specific monoclonal antibodies, and to confirmed our hypothesis on involvement of cleavage of intracellular domain of CD44 (ICD) and migration of ICD in the nucleus, we have used the THP-1 (AML-M5 subtype) cell line and the CHO cell line transfected with a CD44 molecule tagged in the C-terminal with the Myc Tag (CD44-Myc). In the first step we have purified ascite H90 MAb by affinity Protein G chromatography, followed by SDS PAGE electrophoresis to analyse the purity of MAb. In second step, we have performed differentiation assays of THP-1 to test the efficacity of the MAb. THP-1 and CHO cells have been selected for the highest CD44-Myc Tag expression after G418 antibiotic (geneticin) selection using FACS analysis. To analyse ICD Tagged (ICD-Myc) localisation in cells, we have first performed analysis of nuclear and cytoplasmic...