Studium prekurzorových forem SARS-CoV-2 3-CL proteázy

Abstract

The SARS-CoV-2 virus (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), the causative agent of the disease COVID-19 (coronavirus disease 2019), is an enveloped virus with a positive RNA genome. After the binding of the virus to the cell receptor and the release of the genome into the cytoplasm, the viral genome is immediately translated. It is translated into a polyprotein consisting of non-structural proteins necessary for viral replication. A part of this polyprotein is also protease 3-CL, which autocatalytically cleaves itself out from this polyprotein and further releases (and thus activates) individual proteins. Due to this key function in virus replication, 3-CL protease has become an important target for the design of specific antiviral drugs. As part of this thesis, we focused on the study of the precursor form of this protease, i.e. the protease that is still embedded in the polyprotein. The precursor form of the 3-CL protease was mimicked by attaching a 100 amino acid extramembrane C-terminal fragment of the nsp4 protein to the N-terminus of the mature form of the protease. The aim was to find out, how the sequence added to the N-terminus of the matured protease affects its enzymatic characteristics. As a part of this work, mutations of the N-terminal autoprocessing site were identified,...

Virus SARS-CoV-2 (z angl. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), původce onemocnění COVID-19 (z angl. coronavirus disease 2019), je obalený virus s pozitivním RNA genomem. Po vazbě viru na receptor buňky a po uvolnění genomu do cytoplazmy dochází k okamžité translaci virového genomu. Překládá se do polyproteinu skládajícího se z nestrukturních proteinů nezbytných pro replikaci viru. Součástí tohoto polyproteinu je také proteáza 3-CL, která se z tohoto polyproteinu autokatalyticky vyštěpuje a dále uvolňuje (a tím aktivuje) jednotlivé proteiny. Vzhledem k této klíčové funkci v replikaci viru se stala proteáza 3-CL významným cílem pro návrh specifických antivirotik. V rámci předložené diplomové práce jsme se zaměřili na studium prekurzorové formy této proteázy, tedy proteázy, která je stále součástí polyproteinu. Prekurzorová forma proteázy 3-CL byla napodobena připojením extramembránového C-koncového fragmentu sousedního proteinu nsp4 o velikosti sto aminokyselin na N-konec maturované formy proteázy. Cílem bylo zjistit, jakým způsobem sekvence přidaná na N-konec maturované proteázy ovlivňuje její enzymové charakteristiky. V rámci práce byly identifikovány mutace N-koncového štěpného místa, které zabrání rozštěpení prekurzoru na maturovanou formu, což umožňuje získání purifikované...