Optimalizace stanovení 5-fluorouracilu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie

Abstract

Diplomová práce se věnuje vývoji metody stanovení 5-fluorouracilu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie, která by mohla být použita ke stanovení účinnosti jeho enkapsulace liposomy. Nejprve byla vyzkoušena separace 1 mM standardu 5-fluorouracilu na několika vybraných typech kolon. Mezi testované kolony patřila C18 kolona, C18 kolona s pozitivní úpravou povrchu, fenyl-hexylová kolona a několik fluorových kolon společně se dvěma HILIC kolonami. Jako mobilní fáze byla ze začátku používána směs skládající se z 10 mM CH3COONH4, pH = 4,5 a MeOH v poměru 98/2. Výsledky ukázaly, že 5-fluorouracil eluuje na všech kolonách v přílišné blízkosti mrtvého času, kde často eluují také různé nečistoty. Aby se předešlo možnému zkreslení signálu 5-fluorouracilu ze strany nečistot potencionálně se vyskytujících v reálném vzorku, bylo vyzkoušeno několik různých obměn chromatografických podmínek. Jako definitivně nejúčinnější se ukázalo přidání 5 mM iontově párového činidla (jmenovitě hydrátu chloridu tetrabutylamonného) do mobilní fáze společně se zvýšením pH na 8,0 pro podporu ionizace analytu. V kombinaci s takto upravenou mobilní fází dosahovala nejlepších výsledků fenyl-hexylová kolona s retenčním časem 4,36 minut, která byla vybrána i pro finální stanovení 5-fluorouracilu v reálných vzorcích liposomů....

This thesis is dedicated to the development of a method for the determination of 5-fluorouracil by high-performance liquid chromatography, which could be used for determination of its encapsulation efficiency by liposomes. First, separation of 1 mM standard of 5-fluorouracil was tested on several types of columns. Among tested columns belonged a C18 column, a C18 column with positive surface modification, a phenyl-hexyl column and several fluoride columns together with two HILIC columns. A mixture containing 10 mM CH3COONH4, pH = 4,5 and MeOH in the ratio of 98/2 was initially used as the mobile phase. The results showed, that 5-fluorouracil elutes on all columns too close to the dead time, where different impurities often elute. To avoid possible distortion of 5-fluorouracil signal by impurities potentially occurring in the real sample, several adjustments of chromatographic conditions were tested. The most effective solution was addition of 5 mM ion-pairing agent (namely tetrabutylammonium chloride hydrate) to the mobile phase, together with adjusting pH to 8,0 to support the ionization of the analyte. In the combination with mobile phase modified in this way, a phenyl-hexyl column with retention time 4,36 minutes reached the best result, therefore it was selected for the final determination of...