Vacuolar aspartic protease of Candida albicans

Abstract

Aspartátové proteázy (AP) mají zásadní význam pro různé buněčné procesy. Tato diplomová práce se zabývá problematikou exprese a charakterizace vakuolární aspartátové endoproteasy Apr1p z Candida albicans a srovnává ji s jejím orthologem Pep4p ze Saccharomyces cerevisiae. Rekombinantní exprese Apr1p v Escherichia coli poskytla neaktivní proenzym, proApr1p. Rozsáhlé snahy o aktivaci nevedly k maturaci Apr1p, což naznačuje závislost aktivace na posttranslačních modifikacích, jako je glykosylace a specifické interakce s jinými proteázami podobně jako u Pep4p. Pokusy o využití vakuolárních enzymů nebo buněčných lyzátů k aktivaci proApr1p byly také neúspěšné, což může být způsobeno křehkostí izolovaných vakuol a komplexní směsí enzymů v buněčných lyzátech ztěžjucií analýzu aktivace. Tyto problémy podtrhují složitou povahu aktivace proteas kdy ani různe in vitro techniky nedokážou simulovat in vivo aktivaci proteas. Slibné výsledky se však objevily u heterologní exprese proApr1p v Saccharomyces cerevisiae, kde frakcionovaný buněčný lyzát vykazovaly specifickou proteolytickou aktivitu při kyselém pH po inhibici jiných proteáz. To by mohlo naznačovat, že Apr1p může být produkován v aktivní formě v rámci eukaryotického systému, nicméně je třeba dále zkoumat jeho purifikaci. Experiment s reciproční výměnou...

Aspartic proteases (APs) are crucial for diverse cellular processes. This thesis delves into the complexities of protein expression and characterization of vacuolar aspartic endoprotease Apr1p from Candida albicans, comparing it to its Saccharomyces cerevisiae ortholog, Pep4p. Recombinant expression of Apr1p in Escherichia coli yielded the inactive proenzyme, proApr1p. Extensive refolding efforts failed to produce mature, active Apr1p, suggesting a reliance on intricate cellular machinery or specific post-translational modifications for activation. Attempts to leverage vacuolar enzymes or cell lysates for proApr1p activation were unsuccessful, potentially due to the fragility of isolated vacuoles and the complex mixture of enzymes in cell lysates. Positive results emerged when Apr1p was expressed in S. cerevisiae, where fractionated cell lysates exhibited specific proteolytic activity at acidic pH after inhibiting serine and metalloproteases proteases. The eukaryotic system can probably produce active Apr1p. However, after preliminary small-scale experiments, upscaling of Apr1p expression in S. cerevisiae will be necessary in order to obtain sufficient amount of protein for further characterization. A reciprocal gene swap experiment, exchanging PEP4 in S. cerevisiae with APR1 and vice versa,...