Vývoj nových radikálových sond pro strukturní charakterizaci proteinů

Abstract

Proteiny jsou důležité biomolekuly, které v buňce zastávají nespočet důležitých funkcí. Protože funkce těchto biomolekul často úzce souvisí s jejich strukturou, bylo vyvinuto mnoho technik sloužících ke studiu jejich trojrozměrného uspořádání, z nichž každá má své přednosti, ale také nevýhody. Chemické zesítění v kombinaci s hmotnostní spektrometrií, které využívá výhod hmotnostní spektrometrie ke strukturní charakterizaci analytu, je jednou z těchto metod. Přestože je tato metoda již dlouho známa, dosud nebylo vyvinuto činidlo vázající postranní řetězce všech proteinogenních aromatických aminokyselin. V této práci byla ověřena reaktivita nového síťovacího činidla, které by mělo selektivně modifikovat postranní řetězce aromatických aminokyselin a také aminokyseliny cysteinu. Toto činidlo bylo navrženo na základě prací s takzvanými Togniho činidly, která slouží k trifluoralkylaci aromátů. K optimalizaci vlivu různých podmínek na výtěžek reakce měřením intaktního proteinu elektrosprejovou ionizací byl vybrán apomyoglobin. Přístup zdola nahoru byl využit k nalezení postranních řetězců, na kterých došlo k modifikaci. Pro tento účel byl kromě apomyoglobinu vybrány proteiny RhoA a HSC70, které ve své struktuře obsahují cysteiny, které netvoří disulfidické můstky. Na základě obdržených dat byla potvrzena...

Proteins are important biomolecules because they carry out many essential functions. Since the structure of these biomolecules is usually closely linked to their function, there are numerous techniques to determine their three-dimensional structure. Exploiting the advantages of mass spectrometry, chemical cross-linking coupled to mass spectrometry is one of the methods that is used for structural characterization of studied molecule. Currently there is no reagent that targets and links all of the aromatic proteinogenic residues found in the sequence of proteins. In this work, we verified the reactivity of newly developed cross-linker towards aromatic residues and sulfhydryl group of cystein. This new reagent is based on the so-called Togni reagents that serve as trifluoralkylation agents. First, we monitored the impact of several different conditions on the composition of the reaction products using apomyoglobin as a model protein and electrosprey ionization as the method of choice. Subsequently we employed bottom up approach to find out which residues were modified. For this purpose we chose apomyoglobin and two other proteins that contain cysteine in its reduced form - RhoA and HSC70. Based on obtained results, we could confirm the ability of the new cross-linker to modify both aromatic residues...