Development and use of deoxyribozymes that generate color and fluorescence

Abstract

1 Abstrakt Nedávná pandemie SARS-CoV-2 ukázala, že lidstvo mohou ohrozit i tak jednoduché organismy, jako jsou viry. Tato krize zdůraznila potřebu včasné a spolehlivé diagnostiky a také rychlého objevu účinných léků proti novým nemocem. Navrhujeme, že obě tyto výzvy lze řešit pomocí deoxyribozymů (katalyticky aktivních molekul DNA). Nejběžnějšími typy signálů jsou světlo, fluorescence, barva a radioaktivita. Některé z těchto signálů mohou být generovány deoxyribozymy, jiné však zatím nikoli. Funkční molekula DNA, která generuje robustní fluorogenní nebo chromogenní signál, by měla pro mnoho aplikací značné výhody ve srovnání s fluorescenčními proteiny, jejichž syntéza je nákladná a pracná, a fluorescenčními RNA aptamery, které jsou náchylnější k degradaci než molekuly DNA. Abychom rozšířili spektrum možných signálů generovaných pomocí DNA, použili jsme in vitro selekci k vývoji deoxyribozymů, které generují silné fluorogenní a chromogenní signály. Deoxyribozymy, které generují fluorogenní signál, toho dosahují defosforylací kumarinového substrátu 4-methylumbelliferylfosfátu (4-MUP). Přenášejí fosfátovou skupinu z 4-MUP na svou vlastní 5' hydroxylovou skupinu. Touto reakcí se nefluorogenní 4-MUP mění na fluorogenní 4-methylumbelliferon (4-MU). Nejaktivnější deoxyribozym identifikovaný v našich studiích jsme...

1 Abstract The recent SARS-CoV-2 pandemic showed how humanity can be threatened by organisms as simple as viruses. This crisis emphasized the need for timely and reliable diagnostics, as well as the fast discovery of effective therapeutics against new diseases. We propose that both challenges can be addressed by deoxyribozymes (catalytically active DNA molecules). The most common types of signals are light, fluorescence, color and radioactivity. Some of these signals can be generated by deoxyribozymes, but others cannot. A functional DNA molecule that generates a robust fluorogenic or chromogenic signal would have significant advantages for many applications compared to intrinsically fluorescent proteins, which are expensive and labour intensive to synthesize, and fluorescent RNA aptamers, which are more prone to degradation than DNA molecules. To broaden the spectrum of possible outcomes generated by DNA, we have used in vitro selection to develop deoxyribozymes, which generate strong fluorogenic and chromogenic signals. Deoxyribozymes that generate a fluorogenic signal achieve this by dephosphorylating the coumarin substrate 4-methylumbelliferyl phosphate (4-MUP). They transfer the phosphate group from 4-MUP to their own 5' hydroxyl group. This reaction converts the non-fluorogenic 4-MUP into the...