Reactive modifications of RNA for bioconjugations with proteins and new enzymatic methods for the synthesis of base-modified RNA

Abstract

Tato disertační práce je zaměřena na enzymovou syntézu na bázi modifikovaných RNA s různými funkčními skupinami, včetně reaktivních pro síťování proteinů, hydrofobních a fluorescenčních skupin nebo afinitních značek. Konstrukce oligonukleotidů modifikovaných na bázi je zabezpečena buď konvenční in vitro transkripcí s T7 RNA polymerázou, nebo inovativním přístupem využívajícím upravené mutantní DNA polymerázy a reakci prodlužování primerů (PEX). V první části práce byl nasyntetizován nový ribonukleosid trifosfátový stavební blok s reaktivní chloracetamidovou funkční skupinou pomocí Sonogashirovy kaplingové reakce ve vodní fázi katalyzované Pd, přímo aplikované na jodovaný nukleotid. Chloracetamidem modifikovaný trifosfát byl poté testován jako vhodný substrát pro in vitro transkripci s T7 RNA polymerázou s cílem zkonstruovat RNA sondy s jednou nebo více reaktivními skupinami. Selektivita chloracetamidem modifikovaných RNA pro thiol, nebo cystein a histidin obsahující (bio)molekuly byla ukázána modelovými biokonjugačními reakcemi a experimenty pro síťování se třemi RNA-vazebnými proteiny s různými strukturami a funkcemi. Účinná tvorba kovalentních RNA-protein aduktů byla potvrzena western blotem, gelovou elektroforézou a hmotnostní analýzou, které byly prováděny za denaturačních podmínek....

This doctoral thesis focuses on the enzymatic synthesis of base-modified RNA probes with diverse functional groups, including reactive cross-linking, hydrophobic and fluorescent moieties, or affinity tags. The construction of nucleobase-modified oligonucleotides is accomplished either through conventional in vitro transcription with T7 RNA polymerase or by an innovative approach leveraging engineered mutant DNA polymerases and primer extension reaction (PEX). In the first section of the thesis, a novel ribonucleoside triphosphate building block with reactive chloroacetamide functionality was synthesised using an aqueous Pd-catalysed Sonogashira cross- coupling reaction, directly applied on iodinated nucleotide. The chloroacetamide modified triphosphate was then tested as a putative substrate for T7 RNA polymerase in in vitro transcription reaction, aiming to construct RNA probes with one or multiple reactive groups. The selectivity of chloroacetamide- modified RNA for thiol-, or cysteine-, and histidine-containing (bio)molecules was demonstrated by model bioconjugation reactions and cross-linking experiments with three RNA-binding proteins of diverse structures and functions. The efficient formation of RNA-protein covalent adducts was confirmed by western blot or gel, and mass spectrometry analyses...