Biofyzikální charakterizace protein-proteinových komplexů s PPM1D

Abstract

Proteinfosfatasa PPM1D je negativním regulátorem odpovědi buněk na poškození DNA. V procesech opravy poškozené DNA má nezastupitelnou funkci tumor supresorový protein p53. Jedním z jeho hlavních negativních regulátorů je právě fosfatasa PPM1D, jejíž exprese je proteinem p53 zároveň řízena. Fyziologicky se PPM1D inaktivací p53 podílí na obnově homeostázy v buňkách. Nadměrná exprese PPM1D je však spojena se vznikem a rozvojem několika typu nádorů. Porozumění mechanismům, jakými dochází k regulaci PPM1D, proto může být důležitým krokem v boji proti nádorovým onemocněním. Struktura PPM1D se kromě kompaktní fosfatasové domény vyznačuje i přítomností několika flexibilních a nestrukturovaných částí. Obtížným úkolem je proto i příprava tohoto proteinu, což výrazně stěžuje možnosti jeho charakterizace in vitro. Proto byl v této práci použit zkrácený protein PPM1D1-397 (PPM1D NTD). S cílem získat stabilní protein o vysoké čistotě byla exprese a purifikace PPM1D NTD extenzivně optimalizována. Získané SAXS data naznačují, že smyčka bohatá na prolin (30-99), která je specifická pro PPM1D, zaujímá v roztoku rozvinutou a pravděpodobně flexibilní konformaci. Dlouhodobým cílem projektu je studium protein-proteinových interakcí fosfatasy PPM1D. Jedním z interakčních partnerů PPM1D je i protein LZAP. Měření...

PPM1D protein phosphatase is a negative regulator of the cellular response to DNA damage. The tumor suppressor protein p53 plays an irreplaceable role in these processes. PPM1D phosphatase is one of its main negative regulators and expression of PPM1D is also regulated by p53. Physiologically, PPM1D contributes to the restoration of cellular homeostasis by inactivating p53. However, overexpression of PPM1D is associated with the development and progression of several types of tumors. Understanding the mechanisms by which PPM1D is regulated could therefore be an important step towards the fight against cancer. The structure of PPM1D is characterized not only by a compact phosphatase domain but also by the presence of several flexible and unstructured regions. Therefore, the preparation of this protein is a challenging task, which significantly complicates its characterization in vitro. For this reason, a truncated protein PPM1D1-397 (PPM1D NTD) was used in this thesis. In order to obtain a stable protein with high level of purity, the expression and purification of PPM1D NTD were extensively optimized. SAXS data suggest that the proline-rich loop (30-99), which is specific to PPM1D, adopts an extended and likely flexible conformation in solution. The long-term goal of the project is to study the...