Exploration of tryptophan in/dispensability in Escherichia coli by recombineering

Abstract

Cellular life as we know it is dependent on all 20 canonical amino acids comprising the majority of all proteins. Study of origins of life has implied that life might have begun its existence with a smaller alphabet. Although imaginable as a hypothetical concept, providing experimental evidence for such organism has proven to be a difficult task, as our understanding of life's many intricacies as well as rational protein design is lacking. Recent advancements in the combinatorial genome editing and in silico protein folding have the potential to open the path towards experimental reductions of the amino acid code. As for a first step in this reduction tryptophan was chosen here as a suitable candidate as this amino acid is currently thought to be among the latest additions to the alphabet. It is one of the least represented amino acids (comprising ~1.5 % of amino acids in Escherichia coli), is coded by one codon. Using Multiplex Automated Genome Engineering (MAGE), a biosynthetic pathway of tryptophan in Escherichia coli was completely deprived of tryptophan. This was achieved by the introduction of an amino acid library lacking tryptophan in the tryptophan coding sites of this operon. Although the reduction in the amino acid alphabet was not massive, it may serve as an indication for the...

Všechen buněčný život je závislý na 20 kanonických aminokyselinách, nezbytných pro stavbu proteinů. Výzkum zabývající se počátkem život naznačuje, že v jeho prvopočátcích si musel vystačit s méně obsáhlou paletou aminokyselin. Tento hypotetický koncept však naráží na nedostatek experimentálních důkazů, zda takový život opravdu může fungovat. Současný rozvoj metod genomového a proteinového inženýrství dláždí cestu pro získání nových poznatků, které by nám umožnili nahlédnout skrz oponu zastírající počátek života. Nejlepším kandidátem k redukci aminokyselinové abecedy byl v této práci zvolen tryptofan. Vzhledem k množství náznaků, že tato aminokyselina byla jedním z posledních přírůstků do této abecedy a toho, že tryptofan patří mezi nejméně zastoupené proteinogenní aminokyseliny (tvoří 1,5 % aminokyselin v proteomu Escherichie coli), nabízí slibnou šanci pro jeho redukci. Tryptofan byl v této práci odstraněn z tryptofanového operonu nahrazením za knihovnu ostatních proteinogenních aminokyselin metodou "Multiplex Automated Genome Engineering" (MAGE). I přes to, že takto redukovaná biosyntetická dráha má daleko k aminokyselinové redukci z celého organismu, slouží tento výsledek jako dobrý indikátor metodické proveditelnosti tohoto cíle. Klíčová slova: Postradatelnost aminokyselin, Evoluce genetického...