Inhibitory Mdm2 a p53 v buňkách akutní myeloidní leukemie

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) is a severe hematooncologic disorder, which is difficult-to-treat and for some of its subtypes does not exist suitable treatment so far. This diploma thesis is focused on one of these novel approaches targeting an interaction between proteins p53 and Mdm2 by small molecules RITA and RG7112. Each of the selected inhibitors targets one of the interaction partners: while RG7112 binds into Mdm2-binding site of p53, RITA interacts with p53 in the binding domain of Mdm2. An effect of these inhibitors on proliferation and viability of AML cell lines was investigated and two of them, MOLM-13 and MV4-11, were selected as displaying opposite sensitivity. More detailed analysis confirmed stress reaction and changes of apoptosis-related proteins in the sensitive lines. In addition to the cell lines, primary AML cells were also examined. Second aim of this thesis was to validate a method of isolation and labeling of exosomes and to investigate the type of exosome interaction with cell membrane. Confocal microscope monitoring revealed that the type of interaction between a target cell and an exosome depends on the recipient cell type: tight contact is observed between AML cells and exosomes, while K562 and HS-5 cell lines internalize exosomes, regardless their origin. Furthermore, we...

Akutní myeloidní leukemie (AML) je vážné hematoonkologické onemocnění, jehož léčba je velmi obtížná a pro mnohé pacienty stále neexistuje vhodný léčebný přístup. Jednou z možných terapií se zabývá tato diplomová práce, která se soustředí na inhibici interakce mezi proteiny p53 a Mdm2 pomocí malých molekul RITA a RG7112. Zvolené inhibitory cílí každý na jeden z interakčních partnerů: zatímco RG7112 se váže k Mdm2 ve vazebném místě pro p53, RITA interaguje s p53 v oblasti vazebné domény pro Mdm2. Byl vyšetřen vliv těchto inhibitorů na proliferaci a viabilitu různých AML linií a z nich byly vybrány dvě linie s opačnou citlivostí, MOLM-13 a MV4-11. Podrobnější analýzou byla potvrzena stresová reakce senzitivních linií a různé stupně změn proteinů souvisejících s apoptózou. Vedle buněčných linií byly analyzovány také vzorky primárních AML buněk. Dalším cílem bylo zavést metodu izolace a značení exosomů a vyšetřit typ interakce exosomů s buněčnou membránou. Pomocí konfokálního mikroskopu bylo zjištěno, že způsob interakce mezi buňkou a exosomy závisí na cílové buňce, nikoliv na druhu mateřské buňky. U AML linií dochází k těsnému kontaktu mezi buňkou a exosomy, zatímco linie K562 a HS-5 exosomy internalizují. Dále jsme zaznamenali odlišně exprimované exosomové markery (CD9, CD63, CD81) u exosomů z různých...