Trávicí asparatátová proteasa z mandelinky bramborové

Abstract

Mandelinka bramborová (Leptinotarsa decemlineata) patří mezi ekonomicky významné herbivorní škůdce. Při degradaci proteinů obsažených v potravě mandelinky hraje důležitou roli aspartátová peptidasa typu kathepsinu D (LdCD). Tato práce popisuje přípravu dvou expresních systémů v Escherichia coli a Pichii pastoris pro produkci rekombinatního LdCD. Byl sestaven a optimalizován protokol pro refolding LdCD z denaturované formy proteinu. Byla popsána aktivace neaktivního zymogenu LdCD a mechanismus odštěpení propeptidu (aktivačního peptidu), které probíhá autokatalyticky v kyselém pH nebo pomocí cysteinové peptidasy legumainu. Byla charakterizována proteolytická aktivita LdCD s využitím flourogenního peptidového substrátu a proteinových substrátů a byly určeny kinetické parametry a pH optimum enzymu. Inhibiční specifita LdCD byla analyzována se sadou peptidasových inhibitorů. LdCD byl významně inhibován pomocí PDI (?potato cathepsin D inhibitor?), proteinového inhibitoru produkovaného v listech brambor. To naznačuje, že PDI je přirozený obranný protein selektivně směrovaným rostlinou proti LdCD ve střevu mandelinky bramborové s cílem blokovat trávicí systém tohoto herbivorního škůdce. V práci je diskutováno potenciální využití PDI při konstrukci transgeních plodin odolných proti hmyzím škůdcům.

Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) is an economically important herbivorous pest. Cathepsin D-like aspartic peptidase (LdCD) plays an important role during protein degradation in the midgut of Colorado potato beetle. This work describes the preparation of two expression systems, namely in Escherichia coli and Pichia pastoris, for the production of recombinant LdCD. The protocol for refolding of denatured LdCD was designed and optimized. Activation of the inactive LdCD zymogen and cleavage of the propetide (activation peptide) were investigated. This process proceeds autocatalytically at acidic pH or with the assistance of the cysteine peptidase legumain. The proteolytic activity of LdCD was characterized using fluorogenic peptidic substrate and protein substrates, and kinetic parameters and pH optimum were determined. The inhibition specificity of LdCD was analyzed using a panel of peptidase inhibitors. LdCD was significantly inhibited by PDI (potato cathepsin D inhibitor), a protein inhibitor produced in potato leaves. This suggests that PDI is a natural defense protein, which is directed against LdCD in the midgut of Colorado potato beetle in order to block the digestion. The potential application of PDI in the construction of transgenic crops resistant against insects is discussed.