Hledání lidských bílkovin ovlivňujících funkci IRES viru hepatitidy typu C

Abstract

Virus žloutenky typu C (HCV) představuje celosvětově rozšířený patogen infikující až 3 % lidské populace. V posledních letech se výzkum nových léčiv proti tomuto viru zaměřuje na jednotlivé kroky v jeho životním cyklu, mimo jiné na iniciaci translace. V případě HCV je iniciace translace závislá na vnitřním vazebném místě pro ribozóm (IRES) a kromě složek translačního aparátu se na ní podílí i další buněčné komponenty tzv. IRES trans-účinkující faktory (ITAF). Tato práce navazuje na předchozí výzkum naší laboratoře zaměřený na hledání nových ITAF. Pro hledání potenciálních ITAF zvyšujících aktivitu IRES HCV byly připraveny nové rekombinantní plazmidové vektory, nové referenční kvasinkové kmeny a byly optimalizovány selekční podmínky připraveného sytému. Rozdíly v růstových vlastnostech referenčních kmenů byly zkoumány a kvantifikovány v selekčních i neselekčních podmínkách. Dále byla provedena série pilotních vysokovýtěžkových transformací kvasinkového kmene pJ69-4A, nesoucího bicistronní konstrukt s IRES HCV, lidskou expresní cDNA knihovnou s cílem optimalizovat transformační účinnost a selekční podmínky a v neposlední řadě i s cílem pokusit se identifikovat nové ITAF. Několik desítek náhodně vybraných klonů získaných v selekčních podmínkách z těchto transformací bylo podrobeno analýze růstových vlastností,...

Hepatitis C virus (HCV) is a worldwide spread pathogen infecting up to 3 % of the human population. Nowadays, research of new drugs against this virus is focused on the individual steps in its life cycle, including the translation initiation. In the case of HCV translation initiation is dependent on the internal ribosome entry site (IRES). Besides of components of the translational machinery also other components of the cell, so called IRES trans-acting factors (ITAF), contribute to its proper progress. This work continues in previous research of our laboratory focused on searching for new ITAF. In order to search for potential ITAF increasing HCV IRES activity new recombinant plasmid vectors and reference strains were prepared and selection conditions of the selection system were optimized. The differences in the growth characteristics of the reference strains were analyzed and quantified under selective and non-selective conditions. A set of pilot high efficiency transformations of the yeast strain pJ69-4A carrying bicistronic construct with HCV IRES were conducted using human expression cDNA library in order to optimize the efficiency of transformation and selection conditions and to attempt to identify new ITAF. Several dozens of randomly selected clones from these transformations obtained under...