Mapping of regulatory elements within 5' region of the Disp3 locus

Abstract

Dispatched 3 (Disp3), gen regulovaný thyroidálním hormonem, je v naší laboratoři intenzivně studován. Podle fenotypu buněk s nadexprimovaným Disp3 a expresního profilu tohoto genu by Disp3 mohl být propojujícím článkem mezi thyroidálním hormonem a homeostázou cholesterolu v mozku. Domníváme se, že by také mohl hrát roli v patogenezi některých neurodegenerativních onemocnění a mozkových nádorů. Tato práce je zaměřena na proces regulace tohoto genu prostřednictvím receptoru pro thyroidální hormon (TR). Konkrétně si dává za cíl identifikovat responsivní elementy, které jsou důležité pro tuto regulaci. Navíc byly hledány také elementy rozpoznávané jaterním receptorem X (LXR), který nasedá na stejně uspořádané repetice jako TR a existuje mnoho genů, které jsou regulovány oběma těmito receptory. Zkombinovali jsme in silico analýzu Disp3 lokusu s luciferázovými reporterovými esejemi. Zaujal nás cluster šesti responsivních elementů predikovaných v blízkosti prvního exonu, z nichž dva se ukázaly být konzervované mezi myší a člověkem. Na základě toho byly připraveny reportéry různě zkrácených variant této 3 kb dlouhé oblasti, které umožnily tuto sekvenci analyzovat detailně. Reportérové eseje nepotvrdily přítomnost žádného klíčového responsivního elementu aktivovaného TR nebo LXR, ale na 3' konci byla objevena oblast...

Dispatched 3 (Disp3), a thyroid hormone-regulated gene, is studied extensively in our laboratory. Phenotype of cells with overexpressed Disp3 and its expression pattern make it a perfect candidate for a molecular link between thyroid hormone action and cholesterol homeostasis in the brain. Moreover, we hypothesize that it might play a role in certain neurodegenerative disorders and brain tumours. This thesis is aimed at the process of regulation of this gene via thyroid hormone receptor (TR), specifically identification of responsive elements of the thyroid hormone receptor that are necessary for the regulation. Also, we searched for elements recognized by liver X receptor (LXR), as LXR binds to the same arrangement of repeats as TR and there are a number of genes regulated by both of them. We combined in silico analysis of the Disp3 locus with reporter luciferase assays. A cluster of six elements identified around the first exon with two of them being conserved among human and mice draw our attention. In order to analyze this sequence in more detail, reporter vectors of various truncations of 3 kb region around exon 1 were constructed and tested in reporter assays. Reporter assays did not reveal any substantial element activated by TR or LXR; on the other hand, region containing repressor element(s)...