Vliv optimalizace genu na rekombinantní expresi lidského cytochromu P450 3A4

Abstract

Cytochrom P450 3A4 je integrální protein vyskytující se v membráně endoplasmatického retikula. U člověka se v nejvyšší míře vyskytuje v jaterní tkáni. Je důležitým enzymem metabolismu xenobiotik. V procesech biotransformace přeměňuje zhruba polovinu všech používaných léčiv. Hlavním cílem diplomové práce bylo ověřit vliv genové optimalizace na heterologní expresi lidského cytochromu P450 3A4. Při řešení práce byly nejprve připraveny a ověřeny expresní konstrukty založené na vektoru pET22b. Byla porovnána efektivita exprese zkrácené formy zájmového proteinu za použití syntetického genu optimalizovaného pro produkci v hostitelském organismu odvozeném od parentálního kmene K-12 vůči produkci stejně zkráceného cytochromu P450 3A4 v témže vektoru ovšem s originálním lidským genem získaným z cDNA. Bylo potvrzeno, že optimalizace nukleotidové sekvence genu pro hostitelský organismus E. coli skutečně činnost exprese zkrácené formy proteinu zvyšuje, i když množství aktivní formy proteinu nedosahuje výtěžků obvyklých u jiných netoxických solubilních proteinů. Kromě toho byl učiněn pokus o produkci kompletní nezkrácené formy lidského cytochromu P450 3A4 v expresním vektoru pET22b. Množství této formy proteinu přítomné v bakteriální membránové frakci však bylo ve srovnání se zkrácenou formou mnohem nižší....

Cytochrome P450 3A4 is integral membrane protein residing in endoplasmic reticular membrane. In human the highest concentration cytochrome P450 3A4 is expressed in liver, where it plays a major role in metabolism of many drugs and xenobiotics. The main aim of the thesis was to evaluate the effect of gene optimization on heterologous expression of human cytochrome P450 3A4. At first expression constructs based on vectors pET22b were prepared. Then the efficiency of heterologous expression of optimized vs. natural gene sequence encoding truncated form of the human cytochrome P450 3A4 compared. The results show that the gen sequence optimized for E. coli strains K12 was expressed in significantly higher efficiency than the original human gene based on cDNA sequence. Another aim was to evaluate the suitability of pET22b based expression vectors for recombinant production of native (complete) form of human cytochrome P450 3A4. The amount of native form of the protein found in bacterial membrane was however substantially lower then that of the truncated form. Keywords: cytochrome P450 3A4, heterologous expression, pET22b, gene synthesis