Characterization of Antirecombinase Activity of Human FBH1 Helicase

Abstract

Homologní rekombinace (HR) je mechanismus nezbytný pro bezchybnou opravu dvouvláknových zlomů v DNA. Tento proces musí být přísně regulován, protože nadměrné množství nežádoucích HR může v buňce vést k nestabilitě genomu, od které je už jen krůček k symptomu předčasnému stárnutí či vývoji zhoubných onkologických onemocnění. Rozhodujícím krokem v procesu HR je tvorba tzv. presynaptického filamentu. Ten vzniká po navázání molekul RAD51 na úsek jednořetězcové DNA, který se vytvoří v okolí dvouvláknových zlomů. Proces HR je kontrolován mj. DNA helikázami. Mezi nimi je i lidská FBH1 (F-box DNA helicase 1) ze SF1 rodiny helikáz. Jedinečným znakem FBH1 helikázy je přítomnost konzervovaného F-box motivu. Díky němu se FBH1 váže v SCF komplexu fungujícího jako E3 ubiquitin ligáza, která určuje proteiny pro degradaci. V procesu HR plní FBH1 úlohu v regulaci stability presynaptického filamentu. Ovšem přesný mechanismus jak FBH1 kontroluje činnost RAD51 ještě nebyl zcela popsán. V této diplomové práci jsme ukázali, že FBH1 helikáza aktivně rozrušuje RAD51 presynaptický filament. Dále jsme in vitro odhalili přímou interakci FBH1 s RAD51 a RPA. Na základě našich výsledků jsme navrhli možný model mechanismu antirekombinázové funkce FBH1 helikázy.

Homologous recombination (HR) is an essential mechanism for accurate repair of DNA double-strand breaks (DSBs). However, HR must be tightly controlled because excessive or unwanted HR events can lead to genome instability, which is a prerequisite for premature aging and cancer development. A critical step of HR is the loading of RAD51 molecules onto single-stranded DNA regions generated in the vicinity of the DSB, leading to the formation of a nucleoprotein filament. Several DNA helicases have been involved in the regulation of the HR process. One of these is human FBH1 (F-box DNA helicase 1) that is a member of SF1 superfamily of helicases. As a unique DNA helicase, FBH1 additionally possesses a conserved F-box motif that allows it to assemble into an SCF complex, an E3 ubiquitin ligase that targets proteins for degradation. FBH1 has been implicated in the restriction of nucleoprotein filament stability. However, the exact mechanism of how FBH1 controls the RAD51 action is still not certain. In this work, we revealed that FBH1 actively disassembles RAD51 nucleoprotein filament. We also show that FBH1 interacts with RAD51 and RPA physically in vitro. Based on these data, we propose a potential mechanism of FBH1 antirecombinase function.