Výzkum Struktury β-N-Acetylhexosaminidasy z Penicillium oxalicum.

Abstract

v češtině β-N-Acetylhexosaminidasa (EC 3.2.1.52) je exoglykosidasa, která má ve vláknitých houbách unikátní vlastnosti. Enzym z těchto organismů je dimerní, inducibilní a extraceluárně sekretovaný. Je exprimovaný jako preproprotein, skládá se ze signální sekvence, dlouhého propeptidu a katalytické podjednotky. Ačkoli je enzym široce rozšířen, jeho struktura se v jednotlivých organismech liší. Bakterie mají hexosaminidasy pouze monomerní. Lidské enzymy jsou stejně jako fungální dimerní, ale jen hexosaminidasy z vláknitých hub mají katalytickou podjednotku asociovanou nekovalentně s propeptidem. Propeptid je nezbytnou součástí aktivního enzymu. Existuje homologní model katalytické podjednotky β-N-acetylhexosaminidasy z Penicillium oxalicum, ale struktura propeptidu zatím vyřešená nebyla. Tato diplomová práce se v první části zabývá optimalizací podmínek produkce a purifikace. V druhé části se zabývá strukturními studiemi β-N-acetylhexosaminidasy z vláknité houby Penicillium oxalicum CCF 3438. Tyto studie byly prováděny pomocí metod chemického sítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Kombinací těchto metod byla odhalena místa nekovalentní interakce katalytické podjednotky a propeptidu. (In Czech)

in English β-N-Acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) is exoglycosidase, which exhibits the unique properties in the filamentous fungi. Enzyme from these organisms are dimeric, inducible and secreted extracelluary. It is expresed as preproprotein, consists of a signal sequence, a large propeptid and a catalytic subunit. Although the enzyme is widely distributed, its structure differs in varies organisms. Bacteria have only monomeric hexosaminidase. Human enzymes are dimeric as well as fungal, but only hexosaminidase from filamentous fungi have the catalytic subunit noncovalently associated with the propeptide. Propeptide is a essential for the enzyme activity. It exists a homologues model of the catalytic subunit of β-N-acetylhexosaminidase from Penicillium oxalicum, but the structure of the propeptide has not yet been solved. The first part of this diploma thesis deals with the optimization of production and purification conditions. The second part deals with structural studies of β-N-acetylhexosaminidases from the filamentous fungi Penicillium oxalicum CCF 3438. These studies were carried out using chemical cross-linking and high resolution mass spectrometry. The combination of these methods revealed region of the noncovalent interaction of the catalytic subunit with the propeptide.