Charakterizace glycinové smyčky alfa podjednotky mitochondriální procesující peptidasy Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Mitochondriální procesující peptidasa (MPP) je heterodimerní enzym patřící do M16B skupiny metaloendopeptidas. Univerzální funkce tohoto enzymu je v rozeznání a odštěpení velké škály sekvenčně i délkou odlišných presekvencí prekurzorů proteinů určených do mitochondrie. MPP se skládá z katalytické β-MPP a pravděpodobně rozpoznávací α-MPP. Nejkonzervovanější oblastí v α-MPP je tzv. glycinová smyčka (GRL - glycine-rich loop), jejíž předpokládaná funkce je v primární interakci s presekvencí prekurzoru proteinu. Fluorescenčními experimenty je možné sledovat změnu konformace GRL po navázání substrátu. V rámci této diplomové práce byly pomocí metody cílené mutageneze vytvořeny konstrukty kódující α-MPP s jediným reportérovým tryptofanovým zbytkem v pozici 289 nebo 299. Tyto formy α-MPP byly nadprodukovány v buňkách E. coli BL21(DE3)+pGroESL. Aktivity dimeru MPP obsahujícího α-MPP s jediným tryptofanovým zbytkem v reportérové pozici byly porovnány s MPP z divokého kmene S. cerevisiae. Použitým substrátem byl prekurzor kvasinkové malátdehydrogenasy s fúzovanou presekvencí (pMDH) ze tří organismů (kvasinky, myši, a melounu) lišící se svou délkou. Aktivity dimeru obsahujícího α-MPP s reportérovým tryptofanovým zbytkem v pozici 289 se pohybovaly okolo 70 %, zatímco aktivity dimeru obsahujícího α-MPP s...

Mitochondrial processing peptidase (MPP) is a heterodimeric enzyme which belongs to M16B subfamily of metaloendopeptidases. A universal function of this enzyme is in recognition and cleavage of great number of mitochondrial preprotein presequences, which differ in length and amino acid sequence. MPP consists of catalytical β-MPP and probably recognizing α-MPP. The most conservative region in α-MPP is GRL - glycine-rich loop. Its function is supposed in primary interaction with preprotein presequence. It is possible to study conformational change of GRL after binding the substrate by fluorescence experiments. In this diploma thesis the constructs coding the α-MPP with the single reporter tryptophan residue in the position 289 or 299 were prepared using site-directed mutagenesis. These forms of α-MPP were produced in E. coli BL21(DE3)+pGroESL. Activities of MPP dimer containing α-MPP with the single tryptophan residue in the reporter position were compared with MPP from wild type of S. cerevisiae. Used substrate was yeast malate dehydrogenase precursor with fused presequence (pMDH) from three organisms (yeast, mouse and melon). These presequences differ in their length. Activities of MPP dimer containing α-MPP with the single reporter tryptophan residue in the position 289 were about 70 % while...