Proteomická a funkční charakterizace izoforem PsbO

Abstract

PsbO (mangan-stabilizující protein) je jedním z vnějších proteinů fotosystému II vázaných z luminální strany. Nachází se ve všech oxyfototrofních organismech a zajišťuje správnou funkci Mn4CaO5 klastru, kde probíhá fotosyntetický rozklad vody. Tato práce je zaměřena především na PsbO vyšších rostlin a jeho izoformy - jejich evoluci a funkce. Bioinformatickými analýzami jsme zjistili, že většina vyšších rostlin exprimuje právě dvě izoformy psbO. Fylogenetický strom vytvořený ze sekvencí PsbO má neobvyklou topologii. Na jednotlivé vzájemně paralogní izoformy se neštěpí u báze, jak by se dalo očekávat, ale spíše až na koncích jednotlivých větví, na úrovni čeledí či ještě nižších taxonomických jednotek. V práci jsme navrhli a diskutovali několik hypotéz evoluce izoforem PsbO. Součástí práce byla detailní identifikace spotů na gelech z 2D IEF-SDS PAGE tylakoidů bramboru, ve kterých se vyskytuje PsbO. Ve většině spotů jsme identifikovali konkrétní variantu izoformy. Nepodařilo se nám nalézt žádné posttranslační modifikace PsbO. Optimalizovali jsme metodu exprese psbO špenátu v E. coli a následné purifikace, která umožňuje získat velké množství správně sbaleného rekombinantního proteinu. Pomocí CD spektrometrie jsme zjistili, že při změnách pH typických pro lumen tylakoidů při změně osvětlení se mírně mění...

PsbO (manganese-stabilizing protein) is the largest extrinsic protein of photosystem II, located on the lumen side of photosystem. It is present in all known oxyphototrophic organisms. PsbO facilitates photosynthetic water splitting, which takes place in an oxygen evolving center (Mn4CaO5 cluster) of photosystem II. This work is focused on PsbO of higher plants and its isoforms, particularly their evolution and functions. Bioinformatic analyses revealed that majority of higher plants express exactly two psbO isoforms. A phylogenetic tree of PsbO sequences has an unusual topology. The two paralogous isoforms do not diverge at the base of the phylogenetic tree, as anticipated, but rather at the end of particular branches, at the level of family or lower taxonomic unit. In this work we propose and discuss several hypotheses concerning evolution of PsbO isoforms. The work further includes detailed analysis and identification of protein spots assigned to PsbO on 2D IEF-SDS PAGE gels of potato thylakoid proteins. We identified predominant version of PsbO isoform in most of the spots. We did not succeed to find any posttranslational modification. We optimized a method of psbO expression in E. coli and subsequent purification, which yielded relatively big amount of properly folded recombinant protein. Analysis of...