Expresní analýza nových B buněčných populací FO buněk charakterizovaných nepřítomností molekuly CD27 a nízkou expresí CD38 molekuly.

Abstract

V rámci projektu podporovaného grantem IGA MZ ČR NKT11414-3 byly pomocí polychromatické průtokové cytometrie charakterizovány v periferní krvi u pacientů s běžnou variabilní imunodeficiencí a u zdravých kontrol byly objeveny dvě nové B buněčné populace. Tyto populace byly definovány jako CD19+ CD27- CD21+ CD38low CD24+ IgM+ FO I a CD19+ CD27- CD21+ CD38low CD24++ IgM++ FO II B buněčné populace. Protože žádná z nalezených populací nebyla dosud popsána ani studována, cílem této práce bylo charakterizovat tyto populace se zaměřením na analýzu variabilních oblastí těžkých řetězců imunoglobulinů a genů kódujících proteiny, které se účastní procesu formování VHDHJH přeskupení (Rag 1, Rag 2 a TdT) produkované buňkami těchto populací. K provedení molekulární analýzy jednotlivých B lymfocytů byla použita průtoková cytometrie, třídění jednotlivých buněk s využitím průtokového cytometru se sortovacím modulem; RT-PCR na úrovni jedné buňky; IgVH, Rag 1, Rag 2 a TdT specifické PCR a sekvenování. Obě populace byly analyzovány u dvou pacientů s běžnou variabilní imunodeficiencí, dvou zdravých kontrol, a dvou pacientů s autoimunitním onemocněním - 1 s revmatoidní artritidou a 1 systémovým lupus erythematodes (jako tzv. "disease control"). K vyhodnocení rozdílů v expresi variabilních oblastí těžkých řetězců...

Two novel B cell populations were characterized in peripheral blood of patients with common variable immunodeficiency and healthy controls were observed using flow cytometry in the study supported by the grant IGA MZ ČR NKT11414-3. These B cell populations were defined as CD19+ CD27- CD21+ CD38low CD24+ IgM+ FO I and CD19+ CD27- CD21+ CD38low CD24++ IgM++ cells. Since none of found populations has ever been described, the aim of this thesis was to characterize these populations with focus on analysis of variable regions of the heavy chains of immunoglobulins and genes coding proteins participating in the process of VHDHJH formation (Rag 1, Rag 2, and TdT) produced by cells of these populations. Flow cytometry, single cell sorting, single-cell RT-PCR, IgVH, Rag 1, Rag 2, and TdT specific PCR amplification and cycle sequencing were employed to perform the molecular analysis in individual B lymphocytes. Both populations in two patients with common variable immunodeficiency, two healthy controls, and in two patients with autoimmune diseases - rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus (as the disease control) - were examined. Finally, the statistical analysis was used to evaluate the differences in expression of variable regions of the heavy chains of immunoglobulins and in Rag1 and 2, and...