Study of the cleavage kinetics of Gag polyprotein from HIV-1 virus by the viral proteinase

Abstract

Polyprotein Gag je prekurzorem strukturních proteinů viru HIV-1 nezbytných pro správné složení, pučení a zrání virové částice v průběhu životního cyklu viru HIV-1. Proces zrání do stádia infekčního virionu je závislý na štěpení polyproteinu Gag a GagPol virovou proteinasou na devíti přesně určených místech. Narušení tohoto štěpení je jedním z hlavních terapeutických cílů v léčbě nákazy HIV. Virus HIV-1 si však vytváří rezistenci k inhibitorům proteinasy vznikem mutací jak v proteinase samotné, tak v jejím substrátu. Štěpení Gagu HIV-1 proteinasou je proces s přesně daným pořadím a rychlostí jednotlivých kroků. Předchozí biochemické studie stanovily kinetické parametry těchto procesů s pomocí oligopeptidů reprezentujících přirozeně se vyskytující štěpicí místa. Tato práce popisuje štěpení samotného polyproteinu Gag, který je přirozeným substrátem HIV-1 proteinasy. Za tímto účelem byl rekombinantně připraven kompletní polyprotein Gag v bakteriálním expresním systému. Bylo provedeno jeho štěpení HIV-1 proteinasou a produkty tohoto štěpení byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a Western blotu. Dále byla porovnána substrátová specifita proteinasy divokého typu a mutované varianty HIV-1 proteinasy vůči kompletnímu divokému typu Gag polyproteinu. Byly pozorovány podstatné rozdíly mezi rychlostmi jednotlivých kroků...

Gag polyprotein is the precursor of HIV-1 structural proteins, required for correct assembly, budding and maturation of viral particle within HIV-1 life cycle. The process of maturation into an infectious virion is dependent on Gag and GagPol cleavage at nine predefined sites by HIV-1 proteinase. Its disruption is one of the main targets of HIV treatment. HIV-1, however, develops resistance to the proteinase inhibitors by creating mutations in both the proteinase and the substrate. The Gag processing by HIV-1 proteinase is a highly sequential process, that happens in specific order and rate. Previous biochemical studies determined the kinetic data of these processes using oligopeptides representing naturally occuring cleavage sites. This thesis describes the cleavage of the Gag polyprotein itself, which is the natural substrate of HIV-1 proteinase. For this purpose, the full-length Gag polyprotein was recombinantly prepared in bacterial expression system. The cleavage was carried out and its products were analyzed via SDS-PAGE and Western blotting. The substrate specificity of the wild-type and mutant HIV-1 proteinase with respect to the full-length wild-type Gag polyprotein was compared. Substantial differences were observed between the rates of individual steps of cleavage by the wild-type and mutant...