Steps towards the development of an in vitro assay of early endosome fusion

Abstract

7. SHRNUTÍ Tato diplomová práce byla zpracována pod záštitou programu SOCRATES/ ERASMUS na Welsh School of Pharmacy v Cardiffu. Cílem mé práce bylo modifikovat již vyvinutou metodu (Wessling-Resnick M. et al., January 1990) a přizpůsobit ji podmínkám tamní laboratoře. Předmětem studia byla subpopulace tzv. časných endosomů, které vznikají těsně při povrchu plasmatické membrány po rozpadu klatrinového pláště. Jednou z jejich vlastností je schopnost spojovat se, fúzovat, čímž vzniká nadbytečná membrána potřebná pro další osud těchto organel. Ve svých experimentech jsem pracovala se dvěma komplementárními markery. Jedním z nich byl avidin navázaný na enzym -galaktosidasu, která štěpí kromě laktosy také syntetické substráty za vzniku příslušných produktů. V této studii byl produktem specifické hydrolýzy methylumbeliferylgalaktosidu intenzivně fluoreskující methylumbeliferon. Druhým markerem byl biotinylovaný transferin. Podstatou komplementarity markerů je vysoká afinita avidinu k biotinu. Dvě skupiny buněk byly inkubovány se zmíněnými markery a po jejich akumulaci v endosomech následovala mechanická destrukce buněk za uvolnění organel. Oba typy endosomů byly smíchány v prostředí podporujícím jejich fúzi. Spojením dvou endosomů nesoucích různé markery došlo k jejich rychlé kombinaci za vzniku komplexu...