Úprava biologického materiálu před HPLC analýzou - stanovení alfa tokoferolu v erytrocytární membráně

Abstract

α-Tokoferol je hlavním antioxidantem buněčných membrán savců, jeho účinky však nespočívají pouze v antioxidační aktivitě. Řada studií poukazuje na to, že hladiny α-tokoferolu v membráně erytrocytů vypovídají lépe o jeho saturaci organismu než hladiny plasmatické. Tato diplomová práce se zabývá stanovením α-tokoferolu pomocí HPLC-UV s využitím diferenciální ultracentrifugace a extrakce tuhou fází (SPE) v přípravě vzorku. Vzorky erytrocytů byly ultracentrifugovány (288 000  g, 3 minuty, 4 řC) v přítomnosti butylhydroxytoluenu (BHT), D-mannitolu, HEPES a CaCl2. Poté byl α-tokoferol extrahován z membrán erytrocytů hexanem pomocí extrakce na tuhou fázi za použití kyseliny askorbové a vnitřního standardu tokoferol acetátu. Extrakt, rozpuštěný v methanolu, byl separován na monolitické koloně Chromolith Performance RP-18e (100  4,6 mm) 100% methanolovou mobilní fází. Absorbance byla změřena při 295 nm.

α-Tocopherol is the principal membrane antioxidant in mammalian cells, although antioxidant is not the only mechanism of this vitamin. Many studies consider erytrocyte α-tocopherol levels to be more suitable to assess the tocopherol status of organism than its plasma levels. This thesis presents erytrocyte membranes α-tocopherol HPLC-UV analysis with diferential ultracentrigation and solid phase extraction sample pretreatment. Red cell samples were ultracentrifuged (288 000 × g, 3 minutes, 4 řC) in the presence of butylated hydroxytoluene (BHT), D-mannitol, HEPES and CaCl2. Then α-tocopherol was extracted from erytrocyte membranes by solid phase extraction with n-hexane in the presence of ascorbic acid and tocopherol acetate internal standard. The extract was dissolved in methanol and separated on the monolithic column Chromolith Performance RP-18e (100  4.6 mm) using a 100% methanol as the mobile phase. The absorbance of α-tocopherol was measured at 295 nm wavelength.