Charakterizace proteinu HelD z Bacillus subtilis

Abstract

ÚVOD: Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) je intenzivně studovaný enzym, který je klíčový pro genovou expresi. V Laboratoři molekulární genetiky bakterií byl objeven nový protein, HelD, interagující s RNAP z bakterie Bacillus subtilis - tedy potenciální transkripční faktor. HelD je protein o velikosti cca 90 kDa, který je příbuzný s proteiny helikázové rodiny UvrD/Rep, rozplétajících DNA ve směru 3'-5'. Role proteinu HelD v buňce nicméně ještě není známá a rovněž nebyla dosud studována případná role HelD v transkripci. CÍLE: Cílem této diplomové práce bylo charakterizovat protein HelD. PŘÍSTUPY: Charakterizace HelD probíhala na třech úrovních: (i) bioinformatická analýza in silico byla použita k nalezení homologů proteinu HelD v jiných bakteriálních druzích; (ii) růstové testy in vivo byly použity pro nalezení fenotypu ΔHelD kmene v porovnání s divokým typem a (iii) biochemické experimenty in vitro byly použity k popsání efektu HelD na transkripci a k otestování, zda dokáže HelD vázat a rozplétat DNA. VÝSLEDKY: Bioinformatická analýza in silico ukázala, že protein HelD se vyskytuje u kmene Firmicutes G+ bakterií důležitých pro průmysl i medicínu. Fenotypové růstové testy odkryly, že HelD je protein důležitý pro rychlou adaptaci buňky na změny v prostředí. Biochemické experimenty ukázaly, že HelD...

BACKGROUND: Bacterial RNA polymerase (RNAP) is an extensively studied enzyme required for gene expression. In our Laboratory we found a new protein named HelD. HelD copurifies with B. subtilis RNAP. HelD is a ~90 kDa protein from the UvrD/Rep helicase family, which contains protein with the 3'-5' DNA unwinding activity. The molecular role(s) HelD in cell are still unknown and its potential role in transcription has not been studied so far. OBJECTIVE: The main aim of this Diploma project was to describe HelD. APPROACHES: The characterization was carried out on three levels: (i) bioinformatics analysis in silico was used to identify HelD homologs in other bacteria; (ii) growth tests in vivo were used to determine the phenotype(s) of the HelD-null mutant strain compared to wt; and (iii) biochemical experiments in vitro were utilized to describe the effects of HelD on transcription, and to test whether HelD has DNA binding and DNA unwinding activities. RESULTS: The in silico analysis revealed that HelD is present in Firmicutes, an industrially and medicinally important group of G+ bacteria. The phenotypic experiments showed that HelD is required for rapid adaptations to nutritional changes in the environment. The biochemical experiments showed that HelD stimulates transcription despite the fact that it...